利用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)提取植物蛋白

發(fā)布時(shí)間：

2014-10-14

概要：

搖勻后高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))，然后真空干燥沉淀，備用。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)16000r/min離心15min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存

一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
　　
　　1、根據(jù)樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入)，準(zhǔn)備提取液放在冰上。
　　
　　2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時(shí))。
　　
　　3、用高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
　　
　　4、提取上清液，樣品制備完成。
　　
　　蛋白質(zhì)提取液：300ml
　　
　　1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
　　
　　2、甘油(Glycerol)75ml
　　
　　3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
　　
　　這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！
　　
二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
　　
　　氯醋酸—丙酮沉淀法
　　
　　1、在液氮中研磨葉片
　　
　　2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然后高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))棄上清。
　　
　　3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇)，搖勻后高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))，然后真空干燥沉淀，備用。
　　
　　4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心(15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn))，可臨時(shí)保存在4℃待用。
　　
　　5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?br /> 　　
　　藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
　　
　　這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！
　　
三、組織：腸黏膜
　　
　　目的：WESTERNBLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　
　　應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：
　　
　　含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
　　
　　倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min
　　
　　高速冷凍離心機(jī)離心：12000g，10min，4度，棄上清
　　
　　加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)
　　
　　振蕩，置室溫20min
　　
　　高速冷凍離心機(jī)離心：7500g，5min，4度，棄上清
　　
　　重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
　　
　　沉淀中加入100％乙醇2ml
　　
　　充分振蕩混勻，置室溫20min
　　
　　高速冷凍離心機(jī)離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀
　　
　　1％SDS溶解沉淀
　　
　　高速冷凍離心機(jī)離心：10000g，10min，4度
　　
　　取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
　　
　　存在的問題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。
　　
　　解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。
　　
　　四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根
　　
　　1、200毫克樣品置于冰上磨碎
　　
　　2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清
　　
　　3、重復(fù)離心5min
　　
　　lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
　　
五、蛋白質(zhì)樣品制備
　　
　　秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進(jìn)行。
　　
　　100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇)，混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
　　
　　按每mg干粉加入20μl(可調(diào))UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度(溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰)臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)16000r/min離心15min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存
　　
六、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
　　
　　(1)sample,液氮研磨
　　
　　(2)裝1.5mlcentrifuge用tube
　　
　　(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul
　　
　　(4)12000rpm,4度,10-15minite
　　
　　(5)取上層液，蛋白質(zhì)就在里面

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